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2023年5月22日，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所汪迎春團隊在Molecular & Cellular Proteomics雜志上發(fā)表了題為“Parallel Proteomic Comparison of Mutants With Altered Carbon Metabolism Reveals Hik8 Regulation of PII Phosphorylation and Glycogen Accumulation in a Cyanobacterium”研究論文。該研究采用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)與PRM靶向蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合的方法，并結(jié)合磷酸化占比率分析和后續(xù)實驗驗證，系統(tǒng)解析藍細菌碳代謝蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并揭示組氨酸激酶Hik8參與碳氮平衡的調(diào)控。

碳代謝是光合生物的核心代謝，涉及眾多蛋白質(zhì)的協(xié)同運作和調(diào)控。在藍藻中，參與碳代謝的蛋白質(zhì)其表達受到多種因子的調(diào)控，包括RNA聚合酶σ因子SigE、組氨酸激酶Hik8、Hik31和其質(zhì)粒上的同源蛋白Slr6041，以及二元信號系統(tǒng)的響應(yīng)應(yīng)答因子Rre37。然而，目前還不完全清楚這些調(diào)控因子是如何特異或協(xié)同調(diào)控參與碳代謝的蛋白或蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。

為了解決這一問題，研究團隊使用了Thermo Scientific™ Orbitrap質(zhì)譜儀結(jié)合TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對野生型和碳代謝調(diào)控因子的缺失突變體進行了橫向的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。TMT定量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)利用EASY-nLC 1000納升液相和LTQ Orbitrap Elite質(zhì)譜采集。蛋白質(zhì)組分析的整體策略如圖1A所示，通過在重復(fù)實驗之間重新排列TMT標(biāo)記的順序，避免了由于每種TMT試劑導(dǎo)致的定量偏差（圖1B）?？偣茶b定出2543種蛋白質(zhì)（覆蓋70%的藍藻蛋白），其中2189種蛋白質(zhì)在至少兩個重復(fù)實驗中包含定量的TMT信息，用于進一步的統(tǒng)計和生物信息學(xué)分析（圖1C）。

圖1.藍藻野生型與碳代謝調(diào)控蛋白突變株在光自養(yǎng)條件下的蛋白質(zhì)組定量鑒定（點擊查看大圖）

所有樣本的重復(fù)實驗均正確聚類，表明定量具有高可重復(fù)性（圖2A）。研究團隊通過學(xué)生t檢驗（p < 0.05）和1.3倍的倍數(shù)變化閾值，分別在Δhik31、Δhik8、Δrre37、ΔsigE和Δslr6041中鑒定出40、116、49、78和129種差異表達蛋白（圖2B）。部分差異表達蛋白通過免疫印跡法進一步驗證，這些蛋白大多與碳代謝相關(guān)（圖2C）。

圖2.碳代謝調(diào)控因子突變體中差異表達蛋白的篩選

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為了更好地可視化至少被兩個碳代謝調(diào)控蛋白調(diào)控的蛋白質(zhì)，研究團隊利用五個碳代謝調(diào)控蛋白作為中心節(jié)點，構(gòu)建了一個包含80種在至少兩個突變株中發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖3）。該網(wǎng)絡(luò)清晰地展示了調(diào)控的交叉作用，這可能對藍藻的生長以及應(yīng)對代謝和環(huán)境變化至關(guān)重要。

圖3. 碳代謝調(diào)控因子共同調(diào)控的差異表達蛋白

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糖原是藍細菌的關(guān)鍵碳源和能量儲存物質(zhì)。在黑暗條件下，糖原分解和細胞呼吸對細胞存活至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，Δhik8突變株中糖原含量顯著降低，而其他突變株未受影響（圖4A）。盡管Δhik8中糖原合成相關(guān)蛋白未顯著下調(diào)，這暗示可能存在一種新的Hik8依賴的糖原積累機制。糖原積累受細胞內(nèi)碳氮比（C/N平衡）調(diào)控，而該平衡通過蛋白PII的磷酸化狀態(tài)感知和調(diào)節(jié)。

研究團隊發(fā)現(xiàn)，組氨酸激酶Hik8特異調(diào)控藍細菌碳氮的主要感受信號PII蛋白第49位絲氨酸(S49)的磷酸化（圖4B和C）。為驗證PII S49位點磷酸化的上調(diào)以及其在Δhik8突變株中的調(diào)控作用，研究團隊采用了PRM靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法，定量分析了野生型和Δhik8突變株在不同營養(yǎng)條件下磷酸肽段的豐度。PRM靶向蛋白質(zhì)組學(xué)利用EASY-nLC 1000納升液相和Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ 質(zhì)譜儀進行定量分析。結(jié)果顯示，在自養(yǎng)（AT）條件下，Δhik8中PII S49磷酸化水平顯著上調(diào)，且遠超TMT定量結(jié)果（圖4D）。考慮到磷酸化會改變肽段的電荷狀態(tài)，從而影響磷酸化肽段和非磷酸化肽段在質(zhì)譜分析中的電離效率和檢測靈敏度，研究團隊進一步計算了PII S49磷酸化占比率。結(jié)果表明，Δhik8中近70%的PII蛋白發(fā)生磷酸化，而野生型中不足4%（圖4E）。

圖4.Δhik8突變體中糖原含量的降低及PII磷酸化水平的上調(diào)

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進一步研究發(fā)現(xiàn)Hik8的缺失導(dǎo)致PII S49磷酸化水平顯著上調(diào)，并伴隨突變體糖原含量和黑暗生存能力顯著下降，而將PII S49突變?yōu)楸彼嵋阅M其去磷酸化狀態(tài)則能恢復(fù)Hik8缺失突變體的糖原含量和黑暗條件下的生存能力（圖5）。

圖5.PII S49A突變恢復(fù)了Δhik8的糖原含量并挽救其在黑暗條件下的生存能力（點擊查看大圖）

總  結(jié)

綜上所述，該研究不僅系統(tǒng)地解析了碳代謝調(diào)控因子和相應(yīng)靶蛋白之間調(diào)控的特異和協(xié)同性，同時還首次揭示了二元信號系統(tǒng)調(diào)控PII的磷酸化，并進而調(diào)控碳氮平衡。由于Hik8是藍藻生物鐘的重要信號輸出組分，該研究說明藍細菌的碳氮平衡也可能受到生物節(jié)律性調(diào)控。