流式細(xì)胞儀的使用操作細(xì)節(jié)

一、操作前準(zhǔn)備

1. 環(huán)境與設(shè)備檢查

• 實驗室環(huán)境：保持室溫20~25℃，濕度40%~70%，避免強光直射和劇烈震動，減少灰塵污染（建議配備空氣凈化器）。

• 設(shè)備外觀檢查：

  • 確認(rèn)管路無泄漏、堵塞或老化（尤其是鞘液、廢液管路）。

  • 檢查激光光源狀態(tài)（如指示燈是否正常，部分儀器需預(yù)熱 30 分鐘以上）。

  • 確保液流系統(tǒng)（鞘液桶、廢液桶）清潔，鞘液需使用超純水或?qū)Ｓ们室?/span>，且過濾膜定期更換（通常每 1~3 個月一次）。

2. 樣本制備

• 單細(xì)胞懸液制備：

  • 組織樣本需通過酶消化、機(jī)械研磨或濾網(wǎng)過濾（推薦 40~70 μm 細(xì)胞篩）制成單細(xì)胞懸液，避免細(xì)胞團(tuán)塊堵塞管路。

  • 血液 / 體液樣本需抗凝處理（如 EDTA、肝素），避免細(xì)胞凝集。

• 染色要求：

  • 熒光抗體染色需在4℃避光條件下孵育 15~30 分鐘，染色后用 PBS 洗滌 2 次，減少非特異性結(jié)合。

  • 活細(xì)胞染色需注意染料毒性（如 PI 僅用于死細(xì)胞染色），染色后盡快上機(jī)（建議 1 小時內(nèi)）。

• 細(xì)胞濃度調(diào)整：通過血球計數(shù)板或自動細(xì)胞計數(shù)器調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?~5×10? cells/mL，避免過高濃度導(dǎo)致液流不穩(wěn)定或管路堵塞。

二、開機(jī)與系統(tǒng)校準(zhǔn)

1. 開機(jī)流程

1. 接通電源，依次開啟計算機(jī)、流式細(xì)胞儀主機(jī)、激光器（若為汞燈等需預(yù)熱）。

2. 啟動控制軟件（如 FlowJo、BD FACSDiva），連接設(shè)備并初始化系統(tǒng)。

3. 運行液流校準(zhǔn)程序：

   • 注入鞘液，觀察壓力值是否穩(wěn)定（通常為 15~30 psi，依儀器型號而定）。

   • 執(zhí)行 “液流對齊”（Fluidic Alignment），通過熒光微球（如 Flow Cytometry Standard Beads）調(diào)整激光聚焦點，確保單細(xì)胞流通過檢測區(qū)域。

2. 光路校準(zhǔn)與補償設(shè)置

• 熒光校準(zhǔn)：使用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球（如 Calibration Beads）校準(zhǔn)各通道熒光強度，確保不同時間點數(shù)據(jù)的一致性。

• 光譜補償（Compensation）：

  • 由于熒光染料發(fā)射光譜重疊，需通過單染樣本（如僅標(biāo)記 FITC 的細(xì)胞）設(shè)置補償參數(shù)，消除通道間串?dāng)_。

  • 示例：若 FITC 信號漏入 PE 通道，需在軟件中調(diào)整 “FITC→PE” 補償值至陰性群體 MFI＜100。

三、樣本檢測操作

1. 上樣與參數(shù)設(shè)置

• 手動進(jìn)樣：

  • 將樣本管放入進(jìn)樣架，選擇 “手動模式”，設(shè)置流速（低速：≤50 μL/min，高速：≥200 μL/min），推薦低速以減少誤差。

  • 丟棄前 200~500 μL 樣本（避免氣泡和邊緣效應(yīng)），待流式圖穩(wěn)定后開始采集數(shù)據(jù)。

• 自動進(jìn)樣（如有）：

  • 編輯進(jìn)樣列表，設(shè)置樣本名稱、采集時間（如采集 10,000 個細(xì)胞或持續(xù) 60 秒），確保樣本針位置準(zhǔn)確。

• 檢測參數(shù)設(shè)置：

  • 必選參數(shù)：前向散射光（FSC，反映細(xì)胞大小）、側(cè)向散射光（SSC，反映細(xì)胞內(nèi)部復(fù)雜性）、熒光參數(shù)（如 FL1~FL4 對應(yīng)不同染料）。

  • 采集模式：選擇 “對數(shù)放大”（適用于熒光信號）或 “線性放大”（適用于 FSC/SSC），根據(jù)樣本特性調(diào)整電壓（PMT 值），使陰性群體位于熒光軸左側(cè) 1/3 處。

2. 數(shù)據(jù)采集與監(jiān)控

• 實時監(jiān)控：

  • 觀察 FSC/SSC 散點圖，排除細(xì)胞碎片（低 FSC/SSC）和聚集體（高 FSC 且 SSC 變異大），可通過設(shè)門（Gating）僅采集單細(xì)胞群體。

  • 監(jiān)測廢液桶容量，避免滿溢污染設(shè)備（建議每檢測 5~10 個樣本傾倒一次）。

• 異常處理：

  • 若出現(xiàn) “液流中斷” 報警，需檢查鞘液是否不足、管路是否漏氣或樣本中有雜質(zhì)，必要時用0.1% Triton X-100沖洗管路后重新校準(zhǔn)。

  • 熒光信號突然降低時，檢查激光器功率、濾光片位置或染色是否失效。

四、關(guān)機(jī)與維護(hù)

1. 關(guān)機(jī)流程

1. 清洗管路：

   • 檢測結(jié)束后，用PBS 或?qū)Ｓ们逑匆?/span>沖洗進(jìn)樣針和管路（建議運行清洗程序 5~10 分鐘），清除殘留細(xì)胞和染料。

   • 若檢測高濃度樣本或黏性液體（如腫瘤組織裂解液），需先用3% 次氯酸鈉溶液沖洗 3 分鐘，再用超純水沖洗干凈。

2. 關(guān)閉系統(tǒng)：

   • 依次關(guān)閉激光器、主機(jī)電源、計算機(jī)，蓋好儀器防塵罩。

   • 記錄使用日志，包括開機(jī)時間、檢測樣本數(shù)、耗材更換情況等。

2. 日常維護(hù)要點

• 每日維護(hù)：

  • 更換廢液桶，用 75% 乙醇擦拭進(jìn)樣針和樣本架，避免交叉污染。

  • 檢查鞘液剩余量，低于 1/3 時及時補充，確保次日正常運行。

• 每周維護(hù)：

  • 清洗鞘液桶和廢液桶，用去離子水沖洗后干燥，避免微生物滋生。

  • 檢查激光校準(zhǔn)狀態(tài)，用標(biāo)準(zhǔn)微球驗證變異系數(shù)（CV 值應(yīng)＜5%）。

• 每月維護(hù)：

  • 更換鞘液過濾膜（若為可更換式），清洗液流系統(tǒng)內(nèi)部組件（需專業(yè)人員操作）。

  • 對光學(xué)元件（如透鏡、濾光片）進(jìn)行除塵，避免灰塵影響檢測靈敏度。

五、安全與注意事項

1. 生物安全：

   • 處理感染性樣本（如臨床標(biāo)本、病毒感染細(xì)胞）時，需在生物安全柜中操作，佩戴手套和護(hù)目鏡，避免樣本濺出。

   • 廢液需經(jīng)高壓滅菌或含氯消毒劑處理后再丟棄，防止生物污染。

2. 激光安全：

   • 避免直視激光光源（尤其是紫外激光），操作時關(guān)閉儀器艙門，維修需由持證人員完成。

3. 耗材管理：

   • 使用專用樣本管（如聚苯乙烯圓底管），避免使用玻璃管或帶蓋試管（可能導(dǎo)致進(jìn)樣針損壞）。

   • 熒光微球和抗體需避光保存于 4℃，避免反復(fù)凍融影響性能。

六、常見問題與解決策略

總結(jié)

流式細(xì)胞儀的操作需兼顧標(biāo)準(zhǔn)化流程與個性化調(diào)整，從樣本制備到數(shù)據(jù)采集的每一個環(huán)節(jié)都會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。定期維護(hù)設(shè)備、規(guī)范操作習(xí)慣，并結(jié)合軟件數(shù)據(jù)分析（如設(shè)門策略、統(tǒng)計學(xué)分析），可最大限度發(fā)揮流式細(xì)胞儀在細(xì)胞分析、免疫分型、凋亡檢測等領(lǐng)域的應(yīng)用價值。新手需通過培訓(xùn)和反復(fù)實踐積累經(jīng)驗，必要時參考儀器說明書或聯(lián)系技術(shù)支持解決復(fù)雜問題。