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　　高致病性禽流感疫情處置技術(shù)規(guī)范（試行）
   
    *項(xiàng) 樣品采集、保存及運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范
   
    采集、保存和運(yùn)輸樣品應(yīng)當(dāng)符合下列要求，并填寫采樣單。
   
    一、樣品采集
   
    （一）病禽
   
    1．至少從5只瀕死禽采集樣品。樣品包括：泄殖腔拭子和氣管拭子（置于緩沖液中）各5個(gè)（小珍禽可采集新鮮糞便）；氣管和肺的混樣5個(gè)，腸管及內(nèi)容物的混樣5個(gè)；肝、脾、腎和腦等組織樣品（不能混樣）各5個(gè)。
   
    2．分別采集至少10個(gè)病雞的血樣（急性發(fā)病期血清）。
   
    （二）病死禽
   
    無發(fā)病禽時(shí)，可從死亡不久的病禽采樣，采樣要求同病禽。
   
    棉拭子單獨(dú)放入容器，容器中盛放含有抗菌素的pH值為7.0-7.4的 PBS液?？股氐倪x擇視當(dāng)?shù)厍闆r而定，組織和氣管拭子懸液中加入*（2000IU/mL）、*（2mg/mL）、*（50μg/mL）、*（10000 IU/mL）。但糞便和泄殖腔拭子所用的抗生素濃度應(yīng)提高5倍。加入抗生素后pH值應(yīng)調(diào)至7.0-7.4。
   
    二、樣品保存和運(yùn)輸
   
    血樣要單獨(dú)存放，不能混合。
   
    樣品應(yīng)密封于塑料袋或瓶中，置于有制冷劑的容器中運(yùn)輸，容器必須密封，防止?jié)B漏。
   
    樣品若能在24小時(shí)內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，冷藏運(yùn)輸。否則，應(yīng)冷凍運(yùn)輸。
   
    若樣品暫時(shí)不用，則應(yīng)冷凍（-70℃或以下）保存。
   
    第二項(xiàng) 血清學(xué)診斷技術(shù)規(guī)范
   
    一. 血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)技術(shù)
   
    (一)材料準(zhǔn)備
   
    1. 96孔V型微量反應(yīng)板，微量移液器（配有滴頭）。
   
    2. 阿氏（Alsevers）液、雞紅細(xì)胞懸液，配制方法見附錄A。
   
    3. pH7.2的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）。
   
    4. 高致病性禽流感病毒血凝素分型抗原和標(biāo)準(zhǔn)分型血清以及陰性血清。
   
    (二) 操作方法
   
    1. 血凝（HA）試驗(yàn)（微量法）
    （1） 在微量反應(yīng)板的1-12孔均加入0.025mL PBS，換滴頭。
   
    （2） 吸取0.025mL抗原加入第l孔，混勻。
   
    （3） 從第1孔吸取0.025mL抗原加入第2孔，混勻后吸取0.025mL加入第3孔，如此進(jìn)行對倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025mL棄之，換滴頭。
   
    （4） 每孔再加入0.025mL PBS。
   
    （5） 每孔均加入0.025mL 1%（V/V）雞紅細(xì)胞懸液（將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻后加入）。
   
    （6） 振蕩混勻，在室溫（20℃-25℃）下靜置40min后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下1hr）。對照孔紅細(xì)胞將成明顯的鈕扣狀沉到孔底。
   
    （7） 結(jié)果判定。將板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無呈淚滴狀流淌。*血凝（不流淌）的抗原或病毒zui高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位（HAU）。
   
    2. 血凝抑制（HI）試驗(yàn)（微量法）
   
    （1） 根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以*血凝的病毒zui高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點(diǎn)滴度為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:64（256除以4）。
   
    （2） 在微量反應(yīng)板的1-11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。
   
    （3） 吸取0.025mL血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸0.025mL于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。
   
    （4） 1-11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025mL，室溫（約20℃）靜置至少30min。
   
    （5） 每孔加入0.025mL的雞紅細(xì)胞懸液輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下1hr），對照紅細(xì)胞將呈顯鈕扣狀沉于孔底。
   
    （三）結(jié)果判定
   
    以*抑制4個(gè)HAU抗原的血清zui高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。
   
    只有陰性對照孔血清滴度不大于21og 2，陽性對照孔血清誤差不超過1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。HI價(jià)小于或等于31og2判定HI試驗(yàn)陰性；HI價(jià)等于41og 2為陽性。
   
    二. 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散（AGID）試驗(yàn)
   
    (一) 材料準(zhǔn)備
   
    1. 硫柳汞溶液、pH7.2的0.01mol/L PBS溶液，配制方法見附錄B。
   
    2. 瓊脂板：制備方法見附錄C。
   
    3. 禽流感瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散抗原、標(biāo)準(zhǔn)陰性和陽性血清。
   
    （二） 操作方法
   
    1. 打孔。在制備的瓊脂板上按7孔一組的梅花形打孔（中間1孔，周圍6孔），孔徑約5mm，孔距2mm-5mm，將孔中的瓊脂用8號針頭斜面向上從右側(cè)邊緣插入，輕輕向左側(cè)方向?qū)傊舫?，勿傷邊緣或使瓊脂層脫離皿底。
   
    2. 封底。用酒精燈輕烤平皿底部至瓊脂剛剛要溶化為止，封閉孔的底部，以防側(cè)漏。
   
    3. 加樣。用微量移液器或帶有6～7號針頭的0.25mL注射器，吸取抗原懸液滴入中間孔(圖1的⑦號)，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清分別加入外周的①和④孔中，被檢血清按編號順序分別加入另外4個(gè)外周孔（圖1的②，③，⑤，⑥號孔）。每孔均以加滿不溢出為度，每加一個(gè)樣品應(yīng)換一個(gè)滴頭。
   
    4. 作用。加樣完畢后，靜置5min～10min，然后將平皿輕輕倒置放入濕盒內(nèi)，37℃溫箱中作用，分別在24h、48h和72h觀察并記錄結(jié)果。
   
    （三） 結(jié)果判定
   
    1. 判定方法。將瓊脂板置日光燈或側(cè)強(qiáng)光下觀察，若標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(圖1的①和④號孔)與抗原孔之間出現(xiàn)一條清晰的白色沉淀線，則試驗(yàn)成立。
   
    2. 判定標(biāo)準(zhǔn)
   
    (1) 若被檢血清孔（如圖1中的②號）與中心抗原孔之間出現(xiàn)清晰致密的沉淀線，且該線與抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清之間沉淀線的末端相吻合，則被檢血清判為陽性。
   
    (2) 被檢血清孔（如圖1中的③號）與中心孔之間雖不出現(xiàn)沉淀線，但標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔（如圖1中的④號）的沉淀線一端向被檢血清孔內(nèi)側(cè)彎曲，則此孔的被檢樣品判為弱陽性（凡弱陽性者應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)，仍為弱陽性者，判為陽性）。
   
    (3) 若被檢血清孔（如圖1中的⑤號）與中心孔之間不出現(xiàn)沉淀線，且標(biāo)準(zhǔn)陽性血清沉淀線直向被檢血清孔，則被檢血清判為陰性。
   
    (4) 被檢血清孔（如圖1中的⑥號）與中心抗原孔之間沉淀線粗而混濁或標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與抗原孔之間的沉淀線交叉并直伸，被檢血清孔為非特異反應(yīng)，應(yīng)重做，若仍出現(xiàn)非特異反應(yīng)則判為陰性。
   
    附 錄 A
   
    HA和HI試驗(yàn)用溶液的配制
   
    1．阿氏（Alsevers）液配制
   
    葡萄糖 2.05g
   
    檸檬酸鈉 0.8g
   
    檸檬酸 0.055g
   
    氯化鈉 0.42g
   
    加蒸餾水至100mL，加熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69kPa 15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?
   
    2．1%雞紅細(xì)胞懸液制備
   
    采集至少3只SPF公雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用pH7.2的0.01mol/L PBS液洗滌3次，每次均以1000r/min離心10min，洗滌后用PBS配成1%（V/V）紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?
   
    附 錄 B
   
    AGP試驗(yàn)用溶液的配制
   
    1．1%硫柳汞溶液的配制
   
    硫柳汞 1.0g
   
    加蒸餾水至 100mL
   
    溶解后，置100mL瓶中蓋塞存放備用。
   
    2． pH7.2的0.01mol/L PBS 的配制
   
    （1）配制25×PB：稱量2.74g*和0.79g二水*加蒸餾水至100mL。
   
    （2）配制1×PBS：量取40mL25×PB，加入8.5g 氯化鈉，加蒸餾水至1000mL。
   
    （3）用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH至7.2。
   
    （4）滅菌或過濾。
   
    （5）PBS一經(jīng)使用，于4℃保存不超過3周。
   
    附 錄 C
   
    瓊 脂 板 的 制 備
   
    稱量瓊脂糖1.0g，加入100mL的pH7.2的0.01mol/L PBS液，在水浴中煮沸使之充分融化，加入8g氯化鈉，充分溶解后加入1%硫柳汞溶液1mL，冷至45℃-50℃時(shí)，將潔凈干熱滅菌直徑為90mm的平皿置于平臺上，每個(gè)平皿加入18mL-20mL，加蓋待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸發(fā)，放普通冰箱中保存?zhèn)溆茫〞r(shí)間不超過2周）。
   
    第三項(xiàng) 高致病性禽流感診斷標(biāo)準(zhǔn)
   
    一、診斷指標(biāo)
   
    （一） 臨床診斷指標(biāo)
   
    1．急性發(fā)病死亡；
   
    2．腳鱗出血；
   
    3．雞冠出血或發(fā)紺、頭部水腫；
   
    4．肌肉和其他組織器官廣泛性嚴(yán)重出血。
   
    （二） 血清學(xué)診斷指標(biāo)
   
    1．H5或H7的血凝抑制(HI)效價(jià)達(dá)到24及以上；
   
    2. 禽流感瓊脂免疫擴(kuò)散（AGP）試驗(yàn)陽性(水禽除外)。
   
    （三） 病原學(xué)診斷指標(biāo)
   
    1．H5或H7亞型病毒分離陽性；
   
    2．H5或H7 特異性分子生物學(xué)診斷陽性；
   
    3. 任何亞型病毒靜脈內(nèi)接種致病指數(shù)（IVPI）大于1.2。
   
    二、結(jié)果判定
   
    （一） 臨床懷疑為高致病性禽流感
   
    符合臨床診斷指標(biāo)1，且至少有臨床診斷指標(biāo)2、3、4之一。
   
    （二） 疑似高致病性禽流感
   
    符合結(jié)果判定（一），且符合血清學(xué)診斷指標(biāo)1或/和2。
   
    （三） 確診
   
    符合結(jié)果判定（二），且至少符合病原學(xué)診斷指標(biāo)1、2、3之一。
   
    第四項(xiàng) 封鎖技術(shù)規(guī)范
   
    一、由所在地畜牧獸醫(yī)行政管理部門劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū)。
   
    二、封鎖令的發(fā)布：畜牧獸醫(yī)行政管理部門報(bào)請本級人民政府對疫區(qū)實(shí)行封鎖，人民政府在接到報(bào)告后，應(yīng)立即做出決定。決定實(shí)行封鎖的，發(fā)布封鎖令。
   
    三、封鎖的實(shí)施：當(dāng)?shù)厝嗣裾M織對疫區(qū)實(shí)施封鎖。在疫區(qū)周圍設(shè)置警示標(biāo)志，在出入疫區(qū)的交通路口建立臨時(shí)性檢疫消毒站，指派專人，配備消毒設(shè)備，禁止易感染活禽進(jìn)出和易感染禽類產(chǎn)品運(yùn)出，對出入人員和車輛進(jìn)行嚴(yán)格消毒。
   
    四、封鎖令的解除：疫區(qū)內(nèi)所有禽類及其產(chǎn)品按規(guī)定處理后，經(jīng)過21天以上的監(jiān)測未出現(xiàn)新的傳染源，且受威脅區(qū)病原檢測陰性，經(jīng)動物防疫監(jiān)督人員審驗(yàn)合格后，由當(dāng)?shù)匦竽莲F醫(yī)行政管理部門向發(fā)布封鎖令的人民政府申請解除封鎖。
   
    第五項(xiàng) 撲殺技術(shù)規(guī)范
   
    撲殺活禽可采取如下方法：
   
    一、窒息
   
    先將待撲殺禽裝入袋中，置入密封車或其它密封容器，通入二氧化碳窒息致死；或?qū)⑶菅b入密封袋中，通入二氧化碳窒息致死。
   
    二、扭頸
   
    撲殺量較小時(shí)采用。根據(jù)禽只大小，一只手握住頭部，另一只手握住體部，朝相反方向扭轉(zhuǎn)拉伸。
   
    三、其它
   
    也可根據(jù)本地情況，采用其它能避免病原擴(kuò)散的致死方法。
   
    第六項(xiàng) 無害化處理技術(shù)規(guī)范
   
    所有病死禽、被撲殺禽及其產(chǎn)品、排泄物以及被污染或可能被污染的墊料、飼料和其他物品應(yīng)當(dāng)進(jìn)行無害化處理。
   
    無害化處理可以選擇深埋、焚化、焚燒等方法，飼料、糞便也可以發(fā)酵處理。
   
    一、深埋
   
    1．深埋點(diǎn)應(yīng)遠(yuǎn)離居民區(qū)、水源和交通要道，避開公眾視野，清楚標(biāo)示。
   
    2．坑的覆蓋土層厚度應(yīng)大于1.5米，坑底鋪墊生石灰，覆蓋土以前再撒一層生石灰?？拥奈恢煤皖愋蛻?yīng)有利于防洪。
   
    3．禽鳥尸體置于坑中后，澆油焚燒，然后用土覆蓋，與周圍持平。填土不要太實(shí)，以免尸腐產(chǎn)氣造成氣泡冒出和液體滲漏。
   
    4．飼料、污染物等置于坑中，噴灑消毒劑后掩埋。
   
    二、焚化、焚燒
   
    1．疫區(qū)附近有大型焚尸爐的，可采用焚化的方法。
   
    2．處理的尸體和污染物量小的，可以挖1.5米深的坑，澆油焚燒。
   
    三、發(fā)酵
   
    飼料、糞便可在地點(diǎn)堆積，密封發(fā)酵。
   
    以上處理應(yīng)符合環(huán)保要求，所涉及到的運(yùn)輸、裝卸等環(huán)節(jié)要避免灑漏，運(yùn)輸裝卸工具要*消毒。
   
    第七項(xiàng) 疫區(qū)清洗消毒技術(shù)規(guī)范
   
    一、成立清洗消毒隊(duì)
   
    清洗消毒隊(duì)?wèi)?yīng)有一名專業(yè)技術(shù)人員指導(dǎo)。
   
    二、設(shè)備和必需品
   
    （一）清洗工具：掃帚、叉子、鏟子、鍬和沖洗用水管。
   
    （二）消毒工具：噴霧器、火焰噴射槍、消毒車輛、消毒容器等。
   
    （三）消毒劑：醛類、氧化劑類、氯制劑類、雙季胺鹽類等合適的消毒劑。
   
    （四）防護(hù)裝備：*、口罩、膠靴、手套、護(hù)目鏡等。
   
    三、養(yǎng)禽場清理、清洗和消毒
   
    （一）首先清理污物、糞便、飼料、墊料等。
   
    （二）對地面和各種用具等*沖洗，并用水洗刷禽舍、車輛等，對所產(chǎn)生的污水進(jìn)行無害化處理。
   
    （三）養(yǎng)禽場的金屬設(shè)施設(shè)備的消毒，可采取火焰、薰蒸等方式消毒。
   
    （四）養(yǎng)禽場圈舍、場地、車輛等,可采用消毒液噴灑的方式消毒。
   
    （五）養(yǎng)禽場的飼料、墊料等作深埋、發(fā)酵或焚燒處理。
   
    （六）糞便等污物作深埋、堆積密封發(fā)酵或焚燒處理。
   
    （七）疫點(diǎn)內(nèi)辦公區(qū)、飼養(yǎng)人員的宿舍、公共食堂、道路等場所，要噴灑消毒。
   
    （八）污水溝可投放生石灰或漂白粉。
   
    四、交通工具清洗消毒
   
    （一）出入疫點(diǎn)、疫區(qū)的交通要道設(shè)立臨時(shí)性消毒點(diǎn)，對出入人員、運(yùn)輸工具及有關(guān)物品進(jìn)行消毒。
   
    （二）疫區(qū)內(nèi)所有可能被污染的運(yùn)載工具應(yīng)嚴(yán)格消毒，車輛的外面、內(nèi)部及所有角落和縫隙都要用清水沖洗，用消毒劑消毒，不留死角。
   
    （三）車輛上的物品也要做好消毒。
   
    （四）從車輛上清理下來的垃圾和糞便要作無害化處理。
   
    五、家禽市場和籠具的清洗消毒
   
    （一）用消毒劑噴灑所有區(qū)域。
   
    （二）飼料和糞便等要深埋、發(fā)酵或焚燒。
   
    （三）刮擦和清洗籠具等所有物品，并*消毒。所產(chǎn)生的污水要作無害化處理。
   
    六、屠宰加工、貯藏等場所的清洗消毒
   
    （一）所有家禽及其產(chǎn)品都要深埋或焚燒。
   
    （二）禽舍、籠具、過道和舍外區(qū)域要清洗，并用消毒劑噴灑。
   
    （三）所有設(shè)備、桌子、冰箱、地板、墻壁等要沖洗干凈，用消毒劑噴灑消毒。
   
    （四）所用衣物用消毒劑浸泡后清洗干凈，其他物品都要用適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行消毒。
   
    （五）以上所產(chǎn)生的污水要作無害化處理。
   
    第八項(xiàng) 散養(yǎng)戶養(yǎng)殖場地和禽舍消毒技術(shù)要求
   
    一、撲殺雞鴨等禽鳥后，場地必須清洗消毒。
   
    二、在清洗消毒之前要穿戴好防護(hù)衣物。
   
    三、禽舍中的糞便應(yīng)*清除，院子里散落的禽糞應(yīng)當(dāng)收集，并作堆積密封發(fā)酵或焚燒處理。
   
    四、清理堆積禽糞時(shí)應(yīng)淋水，不得揚(yáng)起糞塵。
   
    五、用消毒劑*消毒場地和禽舍，用過的個(gè)人防護(hù)物品如手套、塑料袋和口罩等應(yīng)銷毀。
   
    六、可重復(fù)使用的物品須用去污劑清洗兩次，確保干凈。
   
    七、將撲殺時(shí)穿過的衣服用70℃以上的熱水浸泡5分鐘以上，再用肥皂水洗滌，在太陽下晾曬。
   
    八、處理污物后要洗手、洗澡。
   
    第九項(xiàng) 撲殺禽鳥工作人員防護(hù)技術(shù)要求
   
    一、穿戴合適的防護(hù)衣物
   
    （一）穿*，或者穿長袖手術(shù)衣再加一件防水圍裙。
   
    （二）戴可消毒的橡膠手套。
   
    （三）戴N95口罩或標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)用口罩。
   
    （四）戴護(hù)目鏡。
   
    （五）穿可消毒的膠靴，或者一次性的鞋套。
   
    二、洗手和消毒
   
    （一）密切接觸感染禽鳥的人員，要用肥皂洗手。
   
    （二）禽鳥撲殺和運(yùn)送人員在操作完畢后，要用消毒水洗手。
   
    三、健康監(jiān)測
   
    （一）所有暴露于感染禽鳥和可疑禽場的人員均應(yīng)接受衛(wèi)生部門監(jiān)測。
   
    （二）出現(xiàn)呼吸道感染癥狀的撲殺人員和禽場工人應(yīng)盡快接受衛(wèi)生部門檢查。
   
    （三）上述人員的家人也應(yīng)接受健康監(jiān)測。
   
    （四）免疫功能低下、６０歲以上和有慢性心臟和肺臟疾病的人員要避免從事與禽接觸的工作。
   
    （五）相關(guān)人員和獸醫(yī)應(yīng)接受血清學(xué)監(jiān)測。
   
    第十項(xiàng) 赴疫區(qū)調(diào)查采訪人員防護(hù)技術(shù)要求
   
    一、需備物品
   
    （一）口罩
   
    （二）乳膠手套
   
    （三）*
   
    （四）一次性帽子或頭套
   
    （五）膠靴
   
    （六）酒精棉球或消毒紙巾
   
    （七）處理污染物的大塑料袋
   
    二、防護(hù)要求
   
    （一）要戴口罩，口罩不得交叉使用，用過的口罩不得隨意丟棄。
   
    （二）必須穿*。
   
    （三）進(jìn)入禽糞污染的地方必須穿膠靴，用后要清洗消毒。
   
    （四）脫掉個(gè)人防護(hù)裝備后要洗手或擦手。
   
    （五）若有可能，應(yīng)當(dāng)洗浴，尤其是出入有禽糞灰塵的場所。
   
    （六）廢棄物要裝入塑料袋內(nèi)，置于地點(diǎn)。
   
    第十一項(xiàng) 飼養(yǎng)人員防護(hù)技術(shù)要求
   
    一、飼養(yǎng)人員與染疫禽鳥或糞便等污染物品接觸前，必須戴口罩、手套和護(hù)目鏡，穿*和膠靴。
   
    二、若散養(yǎng)戶飼養(yǎng)人員沒有這些防護(hù)裝備，要盡可能變通使用其他物品代替。如用布遮蓋口鼻代替口罩，用塑料袋包頭和腳，可洗滌的東西裹在身上等。
   
    三、參與處理禽鳥及相關(guān)清洗消毒工作的，應(yīng)穿戴好防護(hù)物品。
   
    四、場地清洗消毒完成后，脫掉防護(hù)物品要洗手、洗澡
   
    五、衣服須用70℃以上的熱水浸泡5分鐘，再用肥皂水洗滌，于太陽下晾曬。
   
    六、銷毀一次性手套、塑料袋和其他相關(guān)物品。
   
    七、膠靴和護(hù)目鏡等要清洗消毒。
   
    八、處理完上述物品要洗手。
   
    九、兒童不得參與上述工作。

頒發(fā)日期:2004年2月3日