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細(xì)胞培養(yǎng)三步驟——復(fù)蘇、傳代、凍存

2025-6-21　閱讀(4)

細(xì)胞培養(yǎng)是指在體外模擬生物體內(nèi)環(huán)境（無(wú)菌、適宜溫度、酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件等），使之生存、生長(zhǎng)、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，是細(xì)胞生物學(xué)研究方法中重要和常用技術(shù)，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)既可以獲得大量細(xì)胞，又可以借此研究細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的合成代謝、細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖等。

細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟可分為：細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存

一、細(xì)胞復(fù)蘇

  1. 細(xì)胞復(fù)蘇的原則：快速融化

在復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)必須遵循快速融化的原則，即必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至 37 ℃，因?yàn)檫@樣可使凍存時(shí)細(xì)胞外的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

  1. 細(xì)胞復(fù)蘇操作過(guò)程

二、細(xì)胞傳代

  1. 細(xì)胞傳代中遇到的問(wèn)題及解決方案：
  • 傳代密度過(guò)高：一旦細(xì)胞養(yǎng)太久至融合度過(guò)高（>90%）才傳代，容易使細(xì)胞產(chǎn)生老化現(xiàn)象，甚至是堆疊，再消化細(xì)胞時(shí)不易吹打成單顆細(xì)胞，即便再重新鋪盤(pán)傳代，細(xì)胞也無(wú)法回到原本的特性了。（如：?jiǎn)螌蛹?xì)胞，沒(méi)長(zhǎng)滿(mǎn)就發(fā)生堆疊現(xiàn)象）

解決方案：盡量避免融合度過(guò)高，鏡下觀察融合度約達(dá)到80%即可傳代分盤(pán)。

  • 傳代密度低：哺乳動(dòng)物貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，若細(xì)胞培養(yǎng)到80-90%密度需要開(kāi)始傳代，在傳代接種細(xì)胞密度過(guò)低，細(xì)胞間距離太遠(yuǎn)，就無(wú)法在細(xì)胞間產(chǎn)生黏附及通信作用，幫助信號(hào)傳導(dǎo)并活化細(xì)胞；總體細(xì)胞量不足，分泌的生長(zhǎng)因子濃度會(huì)不足以產(chǎn)生利于生長(zhǎng)的微環(huán)境，以上皆會(huì)造成增殖速度遲緩或細(xì)胞死亡。

解決方案：細(xì)胞傳代時(shí)，要進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)，確保鋪盤(pán)的密度。

  1. 細(xì)胞傳代操作過(guò)程：

三、細(xì)胞凍存

  1. 細(xì)胞凍存的基本原理：慢凍
  • 手動(dòng)降溫：將細(xì)胞依序放在4℃（30分鐘）、-20℃（1小時(shí)）、-80℃（過(guò)夜）后移至液氮中保存。
  • 程序降溫盒：是一般泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器（填充異丙醇或依靠特制金屬導(dǎo)熱），使細(xì)胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃（過(guò)夜），然后移至液氮中保存。
  • 免液氮程序降溫儀：一種新型自動(dòng)化程序降溫方法，通過(guò)微處理器精確控制冷卻速率和樣品溫度，能夠控制樣品線(xiàn)性/非線(xiàn)性降溫，能夠有效減少凍融過(guò)程對(duì)于細(xì)胞或組織的傷害，重現(xiàn)性好，降溫過(guò)程可控，成本低。（例如點(diǎn)成生物CRF-1免液氮程序降溫儀）
  1. 細(xì)胞凍存操作過(guò)程：

點(diǎn)成生物產(chǎn)品推薦：CRF-1程序降溫儀



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