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2025-6-21 閱讀(6)
微生物定量的常用方法可以大致的分為計(jì)數(shù)法和比濁法。計(jì)數(shù)法的依據(jù)是通過取部分樣品，稀釋，計(jì)數(shù)，之后換算成待測(cè)樣品的一種方法。比濁法主要是通過OD值進(jìn)行反映，具體下文中會(huì)講到。這兩種方法很難說優(yōu)劣，其實(shí)在實(shí)際操作過程中都搭配著使用，相互有各自的適用范圍，使得到的結(jié)果更精確。本篇的講述主要適用于比濁法。
在微生物的定量分析中，通過OD值反映微生物的濃度或數(shù)量是一種常用的方法。很多文章都提到其原理是細(xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成正比，與光密度成反比。它的理論依據(jù)為光吸收的基本定理——朗伯比爾定律。
朗伯-比爾定律（Beer-Lambert Law）是光吸收的基本定律，適用于所有的電磁輻射和所有的吸光物質(zhì)，包括氣體、固體、液體、分子、原子和離子。比爾-朗伯定律是比色分析及分光光度法的理論基礎(chǔ)。光被吸收的量正比于光程中產(chǎn)生光吸收的分子數(shù)目。
A=lg(1/T)=Kbc
朗伯-比爾定律成立條件是待測(cè)物為均一的稀溶液、氣體等，無溶質(zhì)、溶劑及懸濁物引起的散射。但細(xì)菌、細(xì)胞等相關(guān)的物質(zhì)并不屬于稀溶液和氣體的范疇。為什么還用OD值反映微生物的濃度呢？
雖然朗伯-比爾定律是一個(gè)有限的定律，但一定濃度下，菌懸液可以看成是溶液，將內(nèi)部的細(xì)菌當(dāng)做均一粒子。有諸多文獻(xiàn)表明，在一定范圍濃度內(nèi)，該階段的光密度跟菌體的濃度成正比。
具體來講，細(xì)菌菌液不能直接適用于朗伯-比爾定律，只是因?yàn)榧?xì)菌是粒狀的物體，才會(huì)跟朗伯-比爾定律的這種方法關(guān)聯(lián)且部分有效。請(qǐng)注意是部分有效?？梢园堰@種方法看成在一些限定條件下的半經(jīng)驗(yàn)方法，這個(gè)限定條件就是微生物處于線性生長(zhǎng)期。
類似理想氣體狀態(tài)方程雖然有諸多的限制條件，但若在誤差的允許范圍內(nèi)，也是可以用來估算氣體狀態(tài)的。
由以上可知，微生物的定量分析并不是像我們想的那樣，把試管一放，儀器一按，就可以得到答案的。下面就為您解答，當(dāng)拿到一份未知濃度的細(xì)菌培養(yǎng)液時(shí)，怎樣用OD值來進(jìn)行定量分析。
（1）怎樣選的波長(zhǎng)？
答：一般都采用550-650，其實(shí)如果波長(zhǎng)一定的話，即之后做標(biāo)準(zhǔn)曲線也是當(dāng)時(shí)測(cè)量的波長(zhǎng)的話，基本沒什么影響。
（2）如果菌液超出該菌種濃度的適用范圍呢？
答：可以稀釋。同行們有個(gè)0.2-0.7的說法，但具體如何，感覺也和微生物種類有很大關(guān)系。反正如果太濃的話，一定要稀釋就對(duì)了。
（3）測(cè)完OD值，你就知道該菌液的微生物數(shù)量了？
答：還沒有。還存在2個(gè)問題：
①測(cè)量OD值的結(jié)果反映一般只是總菌數(shù)。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，OD值和活菌數(shù)呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，但穩(wěn)定期時(shí)，細(xì)菌的一部分在生長(zhǎng)，一部分已經(jīng)死亡，此時(shí)反映的只能是總菌數(shù)的增多，但活菌數(shù)卻無法反映。
②當(dāng)菌體較為規(guī)則，菌群分布較為均勻，干擾OD測(cè)量的因素較少，但對(duì)于菌體過大或絲狀菌體懸液，如絲狀真菌，則會(huì)因?yàn)榉植季鶆蚨燃罢凵浞瓷溆绊懝馕盏葐栴}導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確。
解決方案：一般行業(yè)中，有估算1 OD=10^8 cells/ml。但是還需要結(jié)合具體的菌種，這里推薦方法是可以提前測(cè)量一下該菌種的標(biāo)準(zhǔn)曲線或得到一個(gè)相關(guān)的方程式。橫坐標(biāo)是OD值，縱坐標(biāo)是該微生物較的計(jì)數(shù)指標(biāo)，采用顯微鏡計(jì)數(shù)、涂板菌落計(jì)數(shù)等，或者流式細(xì)胞儀都可以，然后你進(jìn)行換算即可得到菌液的微生物數(shù)量了。
麥?zhǔn)先槟z標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)液用于質(zhì)量控制程序中，以調(diào)整用于鑒定和敏感性測(cè)試的細(xì)菌懸液的密度。
